Piotr Wojciechowskia , Elżbieta Zienkiewicz§ ,
Antoni Kozioł
a , Andrzej Noworytaa

a Instytut Inżynierii Chemicznej PWr.
§ Instytut Chemii Fizycznej i Teoretycznej PWr.

 

Analiza Modelowa Kinetyki reakcji enzymatycznej hydrolizy skrobi przy udziale endo- i egzo-enzymów amylolitycznych

 

W pracy przedstawiono podstawowe założenia opracowanych modeli kinetycznych opisujących proces enzymatycznej hydrolizy skrobi z udziałem enzymów amylolitycznych. Modele uwzględniają m.in. złożoność substratu oraz jego zmienność w czasie, powstawanie w wyniku reakcji szeregu produktów pośrednich, które mogą być substratami w kolejnych etapach reakcji, występowanie wielu produktów końcowych oraz możliwość zajścia reakcji kondensacji (reverse reactions). Model iteracyjny dodatkowo umożliwia analizę układów wieloenzymatycznych oraz uwzględnienie takich zjawisk jak inhibicja, konkurencja, czy synergizm pomiędzy enzymami.

1. Wstęp

Enzymatyczna hydroliza skrobi jest procesem niezwykle złożonym, przy opisie którego niejednokrotnie zawodzą klasyczne modele. Przykładowo podczas hydrolizy skrobi przy udziale a -amylazy, paradoksalnie stężenie masowe substratu w pierwszym etapie reakcji jest stałe, a stężenie molowe rośnie, natomiast w przypadku b -amylazy w pierwszym etapie reakcji stężenie masowe ulega zmniejszeniu, natomiast stężenie molowe surowca jest stałe! Przeważająca część spotykanych w literaturze modeli degradacji skrobi traktuje skrobię jako jednorodny substrat, opisując jedynie zmianę sumarycznego stężenia substratu lub jednego produktu reakcji (patrz Tab.1) co nie pozwala na dokładną analizę składu mieszaniny reakcyjnej. W niniejszej pracy przedstawiono podstawowe założenia zmodyfikowanego równania multisubstratowego Michaelisa-Menten [12] dla omawianego zagadnienia, a także zaprezentowano dwa modele opisujące hydrolizę skrobi pod wpływem działania enzymów amylolitycznych. Na szczególną uwagę zasługuje model iteracyjny, który pozwala uwzględnić szereg zjawisk towarzyszących procesowi enzymatycznej hydrolizy skrobi, stwarza możliwość symulacji reakcji wieloenzymatycznych oraz umożliwia prognozowanie zmian składu mieszaniny reakcyjnej podczas trwania procesu.

Tab. 1. Przykładowe modele kinetyczne stosowane do opisu reakcji enzymatycznej degra-dacji biopolimerów (w Tabeli przyjęto oznaczenia wg autorów poszczególnych artykułów).

enzym (enzymy)

warunki eksperymentu

Proponowany opis kinetyczny

a -amylaza z Schwanniomyces castelli 1% skrobia; 32° C; pH 5,0 [1] równanie Michaelisa-Menten z inhibicją produktem reakcji.
a -amylaza ze słodu ekstrakt słodowy; 40 ¸ 70° C [2] reakcje pierwszego rzędu dla każdego produktu; reak-cja pierwszego rzędu opisująca dezaktywacje enzymu
a -amylaza z Bacillus licheniformis
(Termamyl 60L)
35% ¸ 55% skrobia pszeniczna; 80° C [3] model nieliniowy: v = f (cs, cw, cE)
a -amylaza z Bacillus licheniformis
(Termamyl 60L)
30% ¸ 50% skrobia pszeniczna; 90 ¸ 120° C [4] nieodwracalna reakcja pierwszego rzędu
a -amylaza z Bacillus sp. typ IIA (Sigma) skrobia ziemniaczana (Aldrich); 20° C; pH 4,5 [23] [5] metoda całkowa połączona z symulacją komputerową bazującą na metodzie Monte Carlo:
endo-(1® 3),(1® 4)-b -D-glukanaza b -glukan (masa 216 kDa oraz 413 kDa) [7] symulacja Monte Carlo (pojedynczy atak losowy), określone stężenie “wykrywalnych” substratów:
a -amylaza z Bacillus licheniformis;
izoamylaza z Pseudomonas amyloderamose
amyloza i amylopektyna;
50
° C; pH 6,0 [8]
model Michaelisa-Menten rozpatrujący cztery typy reakcji przebiegających w roztworze i zakładający inhibicje niskocząsteczkowymi produktami reakcji
a -amylaza z Bacillus subtilis (Koch-Light 0394t);
b -amylaza ze słodkich ziemniaków (Boehringer 15471)
dwie frakcje skrobi (1%);
a -amylaza: 30° C; pH 5,5;
b -amylaza: 30° C; pH 4,8 [9]
dwie pierwszorzędowe reakcje następcze (atak poje-dynczy, atak wielokrotny, atak na kilka łańcuchów):
a -amylaza (Miles-Taka-Therm L-170) z Bacillus licheniformis;
glukoamylaza (Diazyme L-200)
mąka z manioku; 85 ¸ 100° C;
pH 5,2
¸ 7,0 [10]
rozszerzenie modelu kinetycznego Smith'a (1970):
b -amylaza (zakupiona w BDH Ltd.); pullulanaza z Aerobacter aerogenes skrobia ziemniaczana wstępnie zhydrolizowana a -amylazą [11] wielomian piątego stopnia:
f(x) = x
5 + ax4 + bx3 + cx2 + dx + e

2. Modele kinetyczne hydrolizy skrobi

2.1. Multisubstatowa kinetyka Michaelisa-Menten

Zaadaptowano model wielosubstratowy Michaelisa-Menten [12] do opisu hyd-rolizy skrobi. Przyjęto, że substratem dla enzymu, nie są same cząsteczki amylozy, bądź amylopektyny, lecz wiązania a -glikozydowe między podjednostkami glukozy. Na rys. 1 przedstawiono zapis reakcji hydrolizy skrobi przy udziale glukoamylazy. Założono, że glukoamylaza hydrolizuje wiązania a -1,4- oraz a -1,6-glikozydowe; możliwość ataku pojedynczego i wielokrotnego oraz katalizowanie przez enzym reakcji kondensacji [14] prowadzącej do powstania maltozy i izomaltozy z dwóch cząsteczek glukozy. Podano także zależność pozwalającą na weryfikację modelu z danymi doświadczalnymi (test glukozowy oraz reakcja z DNS [13]).

Reakcja:
  1. Hydroliza wiązań a -1,4-glikozydowych:
  2. Hydroliza wiązań a -1,6-glikozydowych (około 20 razy wolniej niż dla wiązań a -1,4-glikozydowych):
  3. Kondencacja - “reverse reaction” (przyjęto, produktami kondensacji są maltoza i izomaltoza):
Analityka:
  1. Reakcja z DNS (ilość “końców redukujących” odpowiadająca sumarycznej ilości cukrów w układzie):
  2. Test glukozowy (całkowita ilość podjednostek glukozy):
Przyjęte na rysunku oznaczenia:
X - -ilość wiązań a -1,4 w substracie
Y
- -ilość wiązań a -1,6 w substracie

E - enzym (glukoamylaza)
G1
- ilość cząsteczek glukozy

G
2
- ilość cząsteczek maltozy
iG2 - ilość cząsteczek izomaltozy

Rys. 1. Skrócony zapis reakcji hydrolizy skrobi katalizowanej przez glukoamylazę w oparciu o równanie multisubstratowe Michaelisa-Menten zakładające atak wielokrotny.

2.2. Model z rozróżnieniem “typów” podjednostek glukozy

Głównym założeniem modelu jest przyjęcie, że podjednostki glukozy w układzie są rozróżnialne pod względem obecności wiązań a -glikozydowych przy poszczególnych atomach węgla w danej podjednostce glukozy, a efektem reakcji enzymatycznej, jest zmiana “typu” podjednostek glukozy, z którymi oddziałuje enzym. Na rys. 2 przedstawiono zapis hydrolizy skrobi przy udziale glukoamylazy.

Reakcje przebiegające w układzie
(uwzględniono także reakcje kondensacji [14]):

Reakcja sumaryczna :

Zestawienie danych doświadczalnych z modelem:

Zmiana stężenia substratu w czasie dla procesu enzyma-tycznej hydrolizy skrobi przy udziale glukoamylazy z Aspergillus niger. Warunki eksperymentu: temp. 20° C; pH 5,0; cS0 = 2,6 mg/ml; cE = 2,53 m g/ml.

Zapis reakcji poprzez zmianę ilości poszczególnych “typów” glukozy:
  • (założono, że enzym nie ulega dezaktywacji)
Wyznaczone stałe kinetyczne dla danych doświadczalnych opisujących hydrolizę skrobi ziemniaczanej przy udziale natywnej glukoamylazy z Aspergillus niger (20° C; pH 5,0):
k1
× E = 2,5 [ml× min-1× mg-1]
k2
× E = 2,5 [ml× min-1× mg-1]
k3
× E = 2× 10-5 [ml× min-1× mg-1]
k4
× E = 2× 10-6 [ml× min-1× mg-1]
k5
× E = 1× 10-6 [ml× min-1× mg-1]
k6
× E = 2× 10-3 [ml× min-1× mg-1]

Do wyznaczenia stałych wykorzystano program Mathematica firmy Wolfram Research Inc.

Analityka:

· Reakcja z DNS (sumaryczna ilość cukrów w układzie) = C + F + G
· Test glukozowy (całkowita ilość podjednostek glukozy) = A + B + C + D + F + G
Przyjęte na rysunku oznaczenia “typów” podjednostek glukozy:
A - wiązania a -1,4 przy C1 , C4 oraz a -1,6 przy C6 ,
B
- wiązania a -1,4 przy węglach C1 oraz C4 ,
C
- wiązanie a -1,4 przy węglu C4 ,
D
- wiązanie a -1,4 przy węglu C1 ,
F - wiązanie a -1,6 przy węglu C6 ,
G
- cząsteczka wolnej glukozy ,
H - wiązania przy C1 i C6 (nie występuje w układzie).
Symbolem
E oznaczono cząsteczkę enzymu (glukoamylazy).

Rys. 2. Model z rozróżnieniem “typów” podjednostek glukozy dla reakcji enzymnatycznej hydrolizy skrobi katalizowanej przez glukoamylazę.

2.3. Model iteracyjny enzymatycznej hydrolizy polimerów

Proponowany model utworzono w oparciu o teorię zderzeń aktywnych oraz analizę Monte Carlo [5, 6]. W sposób losowy określane jest miejsce ataku enzymu na substrat. Następnie zależnie od preferencji substratowych danego enzymu, określa się, czy enzym jest w stanie “rozciąć” cząsteczkę w danym miejscu. Rozpatrywane są dwa typy zderzeń: zderzenia produktywne, prowadzące do hydrolizy wiązania glikozydowego oraz zderzenia nieproduktywne. Proces powtarzany jest w sposób iteracyjny do póki w obecnych w układzie cząsteczkach są wiązania glikozydowe podatne na działanie danego enzymu .

Rozszerzając model można uwzględnić m. in. atak wielokrotny; typy inhibicji (substratową, produktami reakcji oraz kompetycyjna, akompetycyjna i niekompetycyjna); inaktywację enzymu; wzajemne oddziaływania enzym-substrat (konkurencja, synergizm), a także warunki sferyczne ataku enzym® substrat. Na szczególną uwagę w opracowanym modelu zasługuje możliwość opisu reakcji wieloenzymatycznych oraz prognozowanie zmian składu mieszaniny reakcyjnej podczas trwania procesu. Zaproponowano prosty i szybki algorytm translacji układu modelowego do rzeczywistego. Poniżej przedstawiono przykładowe zestawienie danych eksperymentalnych z symulacją komputerową.

Rys. 3. Zestawienie danych doświadczalnych (zaznaczone na wykresie jako trójkąty) z symulacją komputerową (linia kropkowana) dla procesu hydrolizy skrobi przy udziale a -amylazy scukrzającej (cE=7,3 m g/ml; cS0=2,48 mg/ml). Na wykres naniesiono dodatkowo wyznaczone przebiegi stężeń produktów pośrednich i cukrów o DP=2¸ 6 (pozostałe linie).

2.4. Weryfikacja modeli w oparciu o dane doświadczalne

Modele zweryfikowano w oparciu o dane kinetyczne dla układów skrobia-a -amylaza, b -amylaza i glukoamylaza. Przeprowadzano dwa rodzaje analiz: reakcje z DNS [13] pozwalające określić ilość cukrów w układzie niezależnie od ich masy oraz test glukozowy określający całkowitą ilość podjednostek glukozy w układzie.

Po wstępnej analizie odrzucono model multisubstratowy M.-M. jako operujący zbyt dużą liczbą parametrów dla opisywanego układu. Dla pozostałych modeli uzyskano zgodność z danymi doświadczalnymi powyżej 95%. Dodatkowo w modelu iteracyjnym określono zmianę frakcji poszczególnych produktów pośrednich i końcowych. Szerszy opis omawianego zagadnienia jest dostępny w sieci Internet pod adresem http://www.iic.pwr.wroc.pl/~siechu/bio/index.html

3. Bibliografia

  1. A.B.Pasari et al., Enzyme Microbiol. Technol., 10, 156-160 (1988).
  2. A.Marc et al., Biotech. Bioeng., 25, 481-496 (1983).
  3. P.Reinikainen et al., Starch, 38, 20-26 (1986).
  4. L.Hakkarainen, P.Linko, J. Food Eng., 4, 135-153 (1985).
  5. A.Noworyta et al., XV Ogólnopolska Konf. Inż. Chem. i Proc., Gdańsk (1995).
  6. H.Nakatani, Biopolymers, 39, 665-669 (1996).
  7. J.V.Carbonell et al., Biotechnol. Bioeng., 60, 105-113 (1998).
  8. J.T.Park, J.E.Rollings, Biotechnol. Bioeng., 44, (1994) oraz 46, (1995).
  9. H.Henriksnäs, T.Lövgren, Biochem. Bioeng., 20, 1303-1307 (1978).
  10. K.Waliszewski et al., International J. of Food and Technology, 27, (1992).
  11. K.Martensson, Biotechnol. Bioeng., 16, 1567-1587 (1974).
  12. R.M.Costa, F.X.Malcata, Bioproc. Engn., 10, 155-159 (1994).
  13. V.Hagenimana et al., Journal of Food Science, 59, (1994).
  14. Z.L.Nikolov et al., Biotech. Bioeng., 34, 694-704 (1989).

Model analisis of starch hydrolysis kinetic by endo- and exo-enzymes

Three kinetic models of enzymatic hydrolysis of starch had been shown. We proposed that “proper” substrates for amylases are glycoside linkages between glucose units, which are sensitive to enzyme attack [5]. These models include multisubstrate reaction, multi-enzymatic reaction and reverse reaction [14]. One of them, the iteration model, gives the “real” concentration of all participles versus time of the depolimerization reaction (Fig. 3).