Modelowa analiza enzymatycznego procesu upłynniania skrobi.

 

Andrzej NOWORYTA, Piotr WOJCIECHOWSKI, Jolanta BRYJAK

 

Instytut Inżynierii Chemicznej i Urządzeń Cieplnych,

Politechnika Wrocławska, ul. Norwida 4/6, 50-373 Wrocław

 

Przeprowadzono badania kinetyki reakcji enzymatycznej hydrolizy skrobi. Wskazano na trudności w interpretacji wyników doświadczalnych. Zaproponowano model rozpatrywanej reakcji. Przeprowadzono symulację komputerową opracowanego modelu, uzyskując bardzo dobrą zgodność z eksperymentem, zarówno co do stechiometrii reakcji, jak i jej kinetyki.

 

Investigations on kinetic of enzymatic reaction for starch hydrolysis have been carried out. The main problems concerning interpretation of experimental results have been pointed out. The relevant model considered reaction has been proposed. The computer simulation of the proposed model revealed an excellent convergence with experimental data as well due to reaction stoichiometry as to its kinetics.

 

1. WSTĘP

a -Amylaza (EC 3.2.1.1) jest enzymem powszechnie występującym w roślinach, zwierzętach i mikroorganizmach. Katalizuje hydrolizę wiązania glikozydowego a -D-(1,4) w skrobi oraz węglowodanach uwalniając maltozo-oligocukry i glukozę,,. Na skalę przemysłową a -amylaza jest powszechnie wykorzystywana do wytwarzania syropów dekstranowych, wysokomaltozowych, wysokoglukozowych oraz syropów fruktozowych. Jako substrat wykorzystywana jest skrobia ziemniaczana, będąca produktem niejednorodnymi zawierająca, w zależności od materiału roślinnego z którego pochodzi, 20¸ 30% amylozy i 70¸ 80% amylopektyny.

 

2. MATERIAŁY I METODY

Do badań użyto a -amylazy z Bacillus sp. typ IIA firmy Sigma oraz skrobi filmy Aldrich.

Do termostatowanego reaktora (20° C) wprowadzano od 10 do 20 cm3 roztworu enzymu, w 0.1M buforze cytrynianowym pH 4.5, o stężeniach od 2.6 do 47.5 g/m3. Po osiągnięciu temperatury 20° C rozpoczynano reakcję dodając tą samą objętość skrobi rozprowadzonej w wodzie, w stężeniach od 0.1 do 10%. W trakcie procesu z reaktora pobierano próbki w przedziale czasu od 15 sekund do 30 minut.

W próbkach oznaczano stężenia cukrów redukujących metodą DNS korzystając z krzywej wzorcowej dla glukozy.

Stężenia substratu oznaczano metodą antronową, a białko metodą Lowry’ego. Za jednostkę aktywności przyjęto ilość enzymu, powodującą uwolnienie 1 mg równoważników glukozy ze skrobi w ciągu 3 minut, w pH=4.5 i temperaturze 20° C.

 

3. WYNIKI

Badania kinetyki reakcji przeprowadzono dla stężeń enzymu od 2.55 do 47.5 g/m3 oraz początkowego stężenia substratu od 0.24 do 24.3 kg/m3. Uzyskano dla poszczególnych stężeń wyjściowych obraz zmiany stężenia reagentów w czasie. Przykładową zależność przedstawiono na rysunku 1.

Wobec trudności określenia stężenia początkowego substratu {pkt. 5.1}, przyjęto, że .

Rys.1. Wykres zależności zmiany stężenia substratu i produktu reakcji w funkcji czasu dla początkowego stężenia skrobi 19 kg/m3 i stężenia enzymu 33.5 g/m3.

 

4. OPRACOWANIE WYNIKÓW

Po wstępnej analizie podjęto próbę opisu kinetyki reakcji za pomocą klasycznego równania Michaëlis’a-Menten:

Parametry równania kinetycznego wyznaczano kilkoma metodami. Na wstępie zrezygnowano z tradycyjnej metody wyznaczenia stałych Km i Vmax metodą Linewear’a-Burk’a, gdyż nie gwarantuje ona zadowalającej poprawności wyniku w przypadku, gdy Km << cS. Ponadto składowe minimalnego odchylenia kwadratowego wnoszą udziały odwrotnie proporcjonalne do stężenia substratu, co w efekcie pociąga za sobą niewspółmierność wyznaczanego poziomu ufności.

W celu wyznaczenia stałych scałkowano równanie Michaëlis’a-Menten otrzymując wyrażenie na zmianę czasu w funkcji stężenia substratu:

.

Stałe k i Km wyznaczano korzystając z metody Marquardta rozumianej jako algorytm iteracyjny postaci:

b(i+1) = b(i) - ( JTJ + l iD2 )-1q(i),

gdzie D2 jest macierzą diagonalną dodatnio określoną reprezentującą dane doświadczalne, a l i skalarem zmiennym od iteracji do iteracji. Przyjęto, że {D2}ii = {JTJ}ii + j , zaś początkowe wartości parametrów jak następuje l 0 = 0.01, j =1. Po każdym kroku, w którym zachowała się dodatnio określoność macierzy, mnożono l przez 0,1 zbliżając się do kierunku newtonowskiego. Jeśli macierz przestała być dodatnio określona, to zwiększano l dziesięciokrotnie wracając do metody najmniejszego spadku Cauchy’go. Metodą tą wyznaczono rząd stałych Km i k.

Ponieważ wartość Km była o rząd niższa od przeciętnej wartości cSO, zdecydowano się wyodrębnić ze zbioru danych doświadczalnych podzbiór danych dla początkowych warunków reakcji. Wyznaczoną na podstawie analizy tego podzbioru stałą Km podstawiono do równania (2) i korzystając z metod regresji nieliniowej wyznaczono stałą k dla całego zbioru wyników.

Poprawności obliczeń zweryfikowano wyznaczając przedział ufności dla nieznanej wartości współczynnika korelacji populacji danych doświadczalnych posługując się przekształceniem Fishera:

.

Dla warunków początkowych obliczona zmienna Z-Fishera wyniosła 2.09, a współczynnik korelacji 0.97.

W celu skorzystania bezpośrednio z równania Michaëlis’a-Menten wyznaczono chwilowe prędkości reakcji. Ponieważ prędkość w punkcie v{tx,cS,x} liczona jako pochodna lewostronna v{tx,cS,x}=(cS,x-cS,x-1)/(tx-tx-1) była no ogół różna od prędkości liczonej jako pochodna prawostronna v{tx,cS,x}=(cS,x+1-cS,x)/(tx+1-tx). Przyjęto arbitralnie, że prędkość będzie wyznaczana w połowie odległości między kolejnymi punktami, jako tangens kąta pomiędzy prostą przechodzącą przez punkty {tx,cS,x} oraz {tx+1,cS,x+1}, a osią odciętych, czyli v{(tx+tx+1)/2,(cS,x+cS,x+1)/2}=(cS,x+1-cS,x)/(tx+1-tx). W przypadku, gdy cS,x<cS,x+1, stosowano kryterium całkowe, wygładzające postać funkcji.

Rys.2. Wykres stężenia produktu w funkcji czasu dla początkowego stężenia skrobi 19 kg/m3 i stężenia enzymu 33.5 g/m3 (wartości przeliczone).

W efekcie uzyskano wartość Km równą 4.1 [kg/m3] oraz k = 44· 103 [m3× kg-1× min-1], które są wielkościami porównywalnymi z cytowaniami. Należy dodatkowo nadmienić, że wielkość parametrów Km i k, zależy nie tylko od rodzaju enzymu, ale także od pochodzenia skrobi, jej przygotowania, preparacji, inkubacji, etc.

 

5. MODEL REKURENCYJNY

Równolegle z matematycznym opracowanie wyników doświadczalnych opracowano model reakcji enzymatycznej hydrolizy skrobi.

5.1. Stechiometria reakcji

Przyjęto, że enzymatyczna reakcja hydrolizy skrobi przebiega w ten sposób, że a -amylaza rozcina łańcuch policukru w miejscu odpowiednio oddalonym od wiązań a -1,6, wycinając jednocześnie cząsteczkę maltozy. Zatem w wyniku pojedynczego kontaktu a -amylazy z policukrem powstają dwa policukry o krótszych łańcuchach, będące substratami dla kolejnych etapów hydrolizy oraz cząsteczką maltozy. W wyniku zachodzącej reakcji zmienia się jakościowo substrat, jego stężenie molowe rośnie, przy wolno malejącym jego stężeniu masowym (wynika to z dysproporcji między masami molowymi policukrów i maltozy).

Efekt ten wywołuje trudności w interpretacji danych doświadczalnych przy użyciu klasycznych równań stosowanych do opisu kinetyki reakcji enzymatycznych. W związku z powyższym przyjęto, że substratem dla reakcji enzymatycznej hydrolizy skrobi są wiązania a -1,4 nie zawarte w dekstrynach granicznych.

5.2. Założenia modelu

Zakłada się, że aby zaszła reakcja, musi dojść do zderzenia efektywnego cząsteczki substratu z enzymem. Cząsteczka enzymu podczas zderzenia może “zaatakować” substrat w miejscu, w którym może dokonać enzymatycznej hydrolizy wiązania wewnątrz łańcucha skrobi i takie zderzenie jest efektywne lub może się zderzyć z inną cząsteczką lub substratem w miejscu nie podatnym na działanie enzymu. W wyniku aktywnego zderzenia enzymu z cząsteczką substratu, enzym rozcinając substrat uwalnia maltozę, a powstałe produkty reakcji są traktowane jako substraty w następnych zderzeniach. W przypadku zderzenia nieefektywnego układ pozostaje bez zmian (rysunek 3, zderzenie 3). Schematycznie przedstawiono powyższy model na rysunku 3.

Rys.3. Model hydrolizy skrobi.

5.3. Komputerowa symulacja modelu

Opracowano program symulujący enzymatyczną hydrolizę skrobi wg założeń powyższego modelu. W przypadku zderzenia nieefektywnego, liczba kroków symulacji zwiększana była o jeden, a komputer symulował ponownie zderzenie enzymu z kolejną (bądź tą samą) cząsteczką. Reakcję uznawano za zakończoną jeżeli po n-tym kroku, żaden z produktów reakcji nie mógł być wykorzystany jako substrat dla enzymu w n+1 kroku.

W efekcie działania programu otrzymywano przewidywany skład mieszaniny (udział mono-, dwu-, trójcukrów oraz dekstryn), liczbę końców redukujących oraz liczbę kroków symulacji odpowiadającą czasowi osiągnięcia maksymalnego stopnia przereagowania.

W modelu komputerowym przeanalizowano następujących możliwości:

podczas “cięcia” enzym wycina cząsteczkę maltozy,

enzym “rozcina” substrat na dwa produkty,

enzym tnie substrat w połowie łańcucha,

enzym tnie substrat w miejscu losowym,

wybór substratu przez enzym nie zależy od wielkości (długości) łańcucha substratu,

enzym preferuje cząsteczki o dłuższych łańcuchach,

enzym zawsze “zderza się” z substratem w miejscu podatnym na działanie enzymu,

oprócz zderzeń z substratem, mogą być rozpatrywane także zderzenia z glukozą, maltozą, maltotiozą lub dekstrynami granicznymi.

Po przeanalizowaniu kombinacji wszystkich możliwości za najbardziej prawdopodobny uznano model, w którym podczas zderzenia enzym-substrat wycinana jest cząsteczka maltozy, enzym przecina substrat w przypadkowym miejscu dla niego dostępnym preferując cząsteczki dłuższe oraz uwzględniane są zderzenia “nieaktywne”. Na rysunku 4 przedstawiono zależność ilości końców redukujących (odpowiadających oznaczanemu stężeniu produktu) od liczby zderzeń dla powyższego modelu.

Rys.4. Zależność liczby końców redukujących od liczby iteracji.

 

Wyniki uzyskane na podstawie symulacji komputerowej porównano z danymi eksperymentalnymi, wybierając dwa punkty, w oparciu o które przeskalowuje się zależność modelową (rysunek 4) na wielkości fizyczne. Przyjęto przeskalowanie dokonać przyjmując cP(t=0)=0 oraz arbitralnie wybierając punkt, dla którego osiągano 50% przereagowania. Przykładowe wyniki przedstawiono na rys. 5. Uzyskano bardzo dobrą zgodność obu przebiegów.

Rys.5. Porównanie symulacji komputerowej z pomiarem
dla początkowego stężenia skrobi 19 kg/m
3 i stężenia enzymu 33.5 g/m3.

6. PODSUMOWANIE

Przeprowadzono badania reakcji hydrolizy skrobi za pomocą a -amylazy. Wyznaczono wartości stałych w równaniu Michaëlis’a-Menten, wskazując na trudności interpretacyjne w przypadku, gdy Km<cS. W oparciu o teorię zderzeń zaproponowano model reakcji enzymatycznej hydrolizy skrobi, który może być rozszerzony na reakcję degradacji (hydrolizy) polimerów. Opracowano program pozwalający na szeroką (wielowariantową) symulację komputerową tego modelu. Wykazano, że model dobrze określa skład mieszaniny reakcyjnej (stechiometria procesu). Wykorzystując jeden arbitralnie wybierany punkt doświadczalny można łatwo zmienne symulacji komputerowej sprowadzić do parametrów opisujących kinetykę reakcji.

 

7. WYKAZ SYMBOLI

Km - stała Michaëlis’a-Menten [kg/m3]

k - stała dysocjacji kompleksu enzym-substrat [m3/kg× min]

v - prędkość reakcji [kg/m3]

cE - stężenie enzymu [g/m3]

cS0 - początkowe stężenie substratu [kg/m3]

cS - stężenie substratu [kg/m3]

cP - stężenie produktu [kg/m3]

i - krok iteracji

n - ilość podjednostek glukozy zawartych w cząsteczce policukru